Academia Mexicana de Ciencias
Boletín AMC/131/16
Ciudad de México, 13 de junio de 2016

• Provocar mutaciones en nematodos en un blanco específico era un proceso que podía tardar años. Hoy en día es mucho más rápido, económico y fácil con esta técnica de edición de ácido desoxirribonucleico.
• Alumnos de Rosa Estela Navarro González, investigadora del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM, averiguaron cómo utilizar CRISPR/Cas9, no fue necesario la compra de ningún equipo adicional; fueron capaces de generar las primeras mutantes en el laboratorio.

Nematodo transgénico fluorescente creado con la técnica de CRISPR/Cas9.
Foto: cortesía Rosa Estela Navarro.
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El nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans), un gusano que en vida adulta apenas mide un milímetro de largo, cuyo genoma —compuesto por 20 mil genes— se parece en dos terceras partes al de una persona, es utilizado como modelo para entender mecanismos básicos del funcionamiento de los seres humanos. Su organismo, transparente totalmente, cuyo desarrollo se puede observar en el microscopio, y un ciclo de vida de tres días, lo convierte en objeto de estudio para la biología del desarrollo.

“Si los seres humanos tenemos 10 proteínas que hacen una función determinada, el gusano tiene solo una o hasta tres por lo que es más fácil entender cómo funcionan esas tres y luego extrapolar ese mecanismo a nuestro funcionamiento; además, podemos ver procesos en vivo, manipular su genoma con la técnica CRISPR/Cas9 para apagar la expresión de genes o expresar proteínas con proteínas fluorescentes”, dijo Rosa Estela Navarro González, quien se especializa en el estudio de células y proteínas involucradas en el desarrollo de los ovocitos del C. elegans.

El nematodo es hermafrodita, por lo que puede autofecundarse, aunque también se pueden usar cruzas de machos con hermafroditas. Su estudio sigue la evolución de las células que darán origen a los óvulos desde que el gusano es un embrión hasta que se forma la gónada, el aparato reproductor del gusano adulto donde se producen los óvulos.

Se ha observado que durante la embriogénesis y la primera etapa larvaria mueren 131 células después de realizar su función. En su laboratorio someten a C. elegans a dos tipos de estrés: hambruna y/o choques de calor para analizar qué papel juega la muerte celular programada o apoptosis en el desarrollo de esas células germinales.

“Cuando sometemos a los gusanos a ayuno o choque de calor vemos que la apoptosis se eleva aún más y estamos estudiando los mecanismos de activación de esta muerte. Otra línea de investigación que tenemos en el laboratorio es someter a los gusanos a estrés para estudiar la formación de gránulos en la gónada en los que se van ácidos ribonucleicos (ARN mensajero)”, comentó la doctora adscrita al Departamento de Biología Celular y del Desarrollo del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM.

Edición genética más precisa
En 2002 se obtuvo el genoma completo de este gusano, desde entonces se han dado grandes pasos en su conocimiento. Cuando alcanza la madurez sexual tiene 959 células organizadas en epidermis, aparatos digestivo y reproductor, y sistemas nervioso y muscular. El periodo de embriogénesis dura 14 horas y su crecimiento larvario se completa en tres días. Cada animal puede tener hasta 300 embriones transparentes que se desarrollan fuera de la madre y pueden observarse fácilmente.

Provocar mutaciones en nematodos en un blanco específico era un proceso que podía tardar años, pues se hacía al azar con químicos, generación tras generación se iba mapeando dónde había caído la mutación, en qué cromosoma, en qué brazo del cromosoma, hasta llegar al gen blanco. Hoy en día es mucho más rápido, económico y fácil con la técnica de edición de ácido desoxirribonucleico CRISPR/Cas9.

“Lo que normalmente hacemos con CRISPR/Cas9 es interrumpir la expresión de un gen. Esto se logra en cuestión de un mes dependiendo de qué tan accesible sea ese gen, porque a veces están muy empacados y no es fácil para la proteína Cas9 (que funciona como tijera al cortar el genoma en un lugar determinado) dar con el blanco. Una vez hecho el corte, la célula repara y cierra, introduciendo las mutaciones o si en la inyección proporcionamos el ADN de la proteína verde fluorescente podemos insertarlo para observar la expresión del gen en el organismo”, explicó la doctora en entrevista para la Academia Mexicana de Ciencias.

Se puede silenciar un gen o hacer que se exprese otro en 30 días, porque aun cuando un gusano pasa en tres días de embrión a adulto con capacidad de reproducirse, el blanco que contiene la información genética deseada se expresa hasta la tercera o cuarta generación. Si se tiene la mutación deseada, se espera otra generación para asegurar que todos los descendientes la lleven. Luego se manda a secuenciar su genoma, lo cual tarda una semana.

“Con la técnica CRISPR/Cas9 encontramos que la proteína TIAR1 se requiere para que haya apoptosis o para que se formen los gránulos en la gónada de los gusanos, este hallazgo lo encontramos al interrumpir la expresión de ese gen, estudiamos a los C. elegans y vimos que ya no se formaban los gránulos o que ya no se morían las células. Poniéndole un marcaje verde fluorescente vimos en dónde se expresaba la proteína”, comentó Navarro.

TIAR1 está conservada en mamíferos, se sabe que participa en la formación de gránulos y para que se dé la apoptosis, pero no se sabe más. A la investigadora y su grupo de investigación les interesa saber qué le podría pasar a un humano si no la tuviera, por lo que con sus estudios quieren extrapolar la información.

Alumnos de Rosa Estela Navarro González averiguaron cómo utilizar CRISPR/Cas9 en el laboratorio, no fue necesario comprar ningún equipo adicional, ya que contaban con las herramientas necesarias, solo consultaron artículos científicos donde se describe cómo usarlo y resolvieron dudas con contactos en el extranjero. Sus alumnos fueron capaces de generar las primeras mutantes en el laboratorio de la UNAM. La investigadora destacó que siendo más eficaz que otras técnicas, como el RNA de interferencia, no es tan infalible, ya que puede haber blancos inespecíficos. Este problema es mayor en un mamífero cuyo genoma es más complejo y la posibilidad de cortar fuera del gen blanco es alta.

Luz Olivia Badillo.